KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS - BIOAUTOGRAFI

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu kromatografi yang berdasarkan proses adsorpsi. Lapisan yang memisahkan terdiri atas fase diam dan fase  gerak.  Fase  diam  yang  dapat  digunakan  adalah  silika  atau  alumina  yang dilapiskan  pada  lempeng  kaca  atau  aluminium.  Jika  fase  diam  berupa  silika  gel maka bersifat asam, jika fase diam alumina maka bersifat basa. Fase gerak yang digunakan umumnya merupakan pelarut organik atau bisa juga campuran pelarut organik (Gritter, 1991).

Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT)  dapat  digunakan  untuk  tujuan  analitik dan  preparatif.  KLT  analitik  digunakan  untuk  menganalisa  senyawa-senyawa organik  dalam  jumlah  kecil  misalnya,  menentukan  jumlah  komponen  dalam campuran  dan  menentukan  pelarut  yang  tepat  untuk  pemisahan  dengan  KLT preparatif.  Sedangkan  KLT  preparatif  digunakan  untuk  memisahkan  campuran senyawa dari sampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya, yang selanjutnya fraksi-fraksi  tersebut  dikumpulkan  dan  digunakan  untuk  analisa  berikutnya (Townshend, 1995).

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari lapisan  tipis menggunakan harga Rf. Harga Rf didefinisikan sebagai berikut (Sastrohamidjojo,

2005):

Harga Rf

Harga-harga  Rf  untuk  senyawa-senyawa  murni  dapat  dibandingkan dengan harga-harga standart. Harga-harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan (Sastrohamidjojo, 2005).  

Hasil KLT dari suatu ekstrak bahan alam dapat digunakan untuk menentukan berbagai aktivitas biologi ekstrak tersebut secara kualitatif. Berbagai aktivitas tersebut antara lain: aktivitas antibakteri, antifungi, dan lain-lain. Metode uji pada bercak hasil KLT disebut dengan bioautografi (Ahmad et al., 2006). Bioautografi dalam uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan berbagai metode, yaitu bioautografi kontak, bioautografi agar overlay, dan bioautografi langsung (Choma, 2005).

a)      Bioautografi kontak

Bioautografi kontak dilakukan dengan meletakkan lempengan kromatogram hasil elusi dari senyawa uji di atas media padat yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Adanya aktivitas antibakteri dari senyawa uji ditandai dengan adanya zona bening.

b)      Bioautografi agar overlay

Bioautografi agar overlay dilakukan dengan melapisi lempeng kromatogram hasil elusi senyawa uji dengan media agar cair yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Setelah agar mengeras, lempengan kromatogram diinkubasi dan diwarnai dengan tetrazolium dye. Penghambatan dapat dideteksi dengan terbentuknya pita (band).

c)       Bioautografi langsung

Bioautografi langsung dilakukan dengan menyemprot lempeng kromatogram hasil elusi senyawa uji dengan mikroba uji dan diinkubasi. Zona hambat yang terbentuk divisualisasikan dengan menyemprot lempeng kromatogram dengan tetrazolium dye.

            Ketiga metode tersebut memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing. Menurut Kusumaningtyas et al. (2008) bioautografi agar overlay memiliki sensitivitas lebih baik dari pada metode yang lain. Akan tetapi, bioautografi kontak lebih mudah dilakukan dan hasilnya telah jelas terlihat. Sedangkan bioautografi langsung merupakan bioautografi yang jarang digunakan karena dilaporkan tidak dapat digunakan untuk sampel tertentu. Oleh karena itu, kombinasi bioautografi kontak dengan langsung menghasilkan bioautografi agar overlay (Kusumaningtyas et al., 2008).