ANALISIS SENYAWA BIOANORGANIK (KCKT DAN AAS)

ANALISIS SENYAWA BIOANORGANIK (KCKT DAN AAS)

( Istohuroh, Wiqoyatul M )

BAB I

PENDAHULUAN

Kimia Bioanorganik adalah sebuah penggabungan antara kimia anorganik dan biokimia sebagai contoh dari kedua disiplin ilmu ini, anorganik merupakan sebuah “isi” yang terdapat dalam sistem hayati, pengobatan terapi, diagnosis, dll. Yang dimaksud isi dapat berwujud ion logam seperti K⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, ion komposit seperti Molibdat dan senyawa koordinasi seperti cis-Platin yang telah banyak digunakan untuk terapi anti kanker. Unsur mineral merupakan salah satu komponen yang sangat diperlukan oleh makhluk hidup di samping karbohidrat, lemak, protein, dan vitamin, juga dikenal sebagai zat anorganik atau kadar abu. Sebagai contoh, bila bahan biologis dibakar, semua senyawa organik akan rusak; sebagian besar karbon berubah menjadi gas karbon dioksida (CO₂), hidrogen menjadi uap air, dan nitrogen menjadi uap nitrogen (N₂). Sebagian besar mineral akan tertinggal dalam bentuk abu dalam bentuk senyawa anorganik sederhana, serta akan terjadi penggabungan antar individu atau dengan oksigen sehingga terbentuk garam anorganik.

Berbagai unsur anorganik (mineral) terdapat dalam bahan biologi, tetapi tidak atau belum semua mineral tersebut terbukti esensial, sehingga terdapat  mineral esensial dan nonesensial. Mineral esensial yaitu mineral yang sangat diperlukan dalam proses fisiologis makhluk hidup untuk membantu kerja enzim atau pembentukan organ. Unsur-unsur mineral esensial dalam tubuh terdiri atas dua golongan, yaitu mineral makro dan mineral mikro. Mineral makro diperlukan untuk membentuk komponen organ di dalam tubuh. Mineral mikro yaitu mineral yang diperlukan dalam jumlah sangat sedikit dan umumnya terdapat dalam jaringan dengan konsentrasi sangat kecil. Mineral nonesensial adalah logam yang perannya dalam tubuh makhluk hidup belum diketahui dan kandungannya dalam jaringan sangat kecil. Bila kandungannya tinggi dapat merusak organ tubuh makhluk hidup yang bersangkutan. Di samping mengakibatkan keracunan, logam juga dapat menyebabkan penyakit defisiensi.

Mineral makro dibutuhkan tubuh dalam jumlah besar, yang terdiri atas kalsium, klorin, magnesium, kalium, fosforus, natrium, dan sulfur. Mineral mikro diperlukan tubuh dalam jumlah kecil, seperti kobalt, tembaga, iodin, besi, mangan, selenium, dan seng. Keperluan optimum akan berbagai mineral tersebut belum banyak diketahui dengan pasti, sedangkan mineral mikro dapat ditemukan pada berbagai bagian tubuh walaupun dalam jumlah sedikit. Kekurangan (defisiensi) mineral, baik pada manusia maupun hewan, dapat menyebabkan penyakit. Sebaliknya pemberian mineral esensial yang berlebihan dapat menimbulkan gejala keracunan. Analisis kandungan mineral dalam jaringan biologik dengan metode spektrofotometri serapan atom dapat mendiagnosis kasus defisiensi atau keracunan mineral. Teknik analisis kadar mineral ini difungsikan untuk mengetahui keseimbangan kadar mineral yang ada dalam tubuh. Sehingga kadar ineral tidak terdapat dalam jumlah yang berlebih atau dalam jumlah yang kurang dalam tubuh.

BAB II

PEMBAHASAN

A.      TEKNIK ANALISIS SENYAWA BIOANORGANIK

Terdapat berbagai cara atau teknik analisis yang dapat digunakan untuk analisis senyawa bioanorganik, diantaranya:

1.    Kromatografi cairan Kinerja Tingkat Tinggi (KCKT)

Kromatografi cairan kinerja tingkat tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut HPLC (High Performance Liquid chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang,  antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan.

Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik, maupun biologis; analisis ketidak murnian (impurities); analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile); penentuan molekul-molekul  netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element); dalam jumlah banyak, dan dalam skala industri.

Keterbatasan KCKT adalah untuk identifikasi senyawa kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spectrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu:

1.         Wadah fase gerak

2.         Sistem penghantaran fase gerak

3.         Alat untuk memasukkan sampel

4.         Kolom

5.         Detektor

6.         Wadah penampung buangan fase gerak

7.         Tabung penghubung

8.         Suatu computer atau integrator atau perekam

Secara terperinci penjelasan tentang instrumentasi KCKT akan diuraikan sebagai berikut :

1.    Wadah fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detector sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuata pelarut untuk fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, dan regaen dengan kemurnian yang tinggi, dan lebih terpilih lagi jika pelarut yang akan diguunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade).

2.    Fase gerak

Daya gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang yang dapat bercampr yang secar akeseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemmapuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari pada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama  elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.

3.    Pompa pada KCKT

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: Pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000Psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3mL/menit. Untuk tujuan preparative,  pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Ada dua jenis pompa dalam KCKT yaitu: pompa dengan tekana konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

4.    Penyuntikan sampel pada KCKT

Pada saat pengisian sampel, sampel digelontorkan melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup dipputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom.

5.    Kolom  pada KCKT

Ada dua jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvennsional dan kolom mikrobor.

6.    Fase diam pada KCKT

Kebanyakan fase diam dalam KCKT merupakan silika yang dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan  divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam  karenanya ada residu gugus silanol. Silika dapat dimodifikasi dengan regaen-regaen seperti korosilan.

7.    Detektor KCKT

Detector pada KCKT dikelompokkan menjadi dua  golongan yaitu : detector universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detector indeks bias dan detector spektrometri massa; dan golongan detector ayng spesifik yang ahnya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif . sperti detector UV-Vis, detector Fluorosensi, dan elektrokimia.

Pada umumnya jenis detektor yang sering digunakan dalam analisis senyawa bioanorganik adalah detektor fluoresense dan detektor UV-Vis. Fluoresensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi ketika suatu senyawa menyerap sinar UV atau Visibel lalu mengemisikannya pada panjang gelombang yang lebih besar. Detektor ini lebih sensitif dan lebih selektif dibandingkan dengan detektor UV. Sedangkan detektor, didasarkan pada adanya penyerapan sinar Ultra violet dan sinar tampak pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur-struktur atau gugus kromoforik. 

8.    Komputer atau perekam

Jenis-jenis KCKT, antara lain; Kromatografi Adsorpsi, Kromatografi Partisi, Kromatografi penukar ion dan Kromatografi eksklusi ukuran. Diantara keempat jenis KCKT tersebut, yang paling sering digunakan dalam analisis senyawa bioanorganik adalah kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi ukuran. Kromatografi penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak ipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Sedangkan kromatografi eksklusi ukuran, fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus atau berdifusi lewat fase diam. 

KCKT mempunyai berbagai bentuk yang sesuai untuk berbagai jenis solut yang berbeda. Sebagai contoh, kromatografi pertukaran ion (ion exchange chromatography = IEC) mampu memisahkan solut anionik atau kationik dalam campuran. Kromatografi ukuran eksklusi dan kromatografi kiral merupakan jenis kromatografi lai yang amsing-masing mampu memisahkan solut dengan berat molekul tinggi dan enansiomer.

Ada 4 jenis mekanisme sorpsi dasar dan umumnya 2 atau lebih ada dalam satu jenis kromatografi. Keempat jenis tersebut adalah; adsorpsi, partisi, pertukaran ion; dan eksklusi.

a.    Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaaanya saja tidak secara keseluruhan. Salah satu contoh yang sering dpakai adalah silika gel, silika gel merupakan jenis adsorben (fase diam) yang penggunaanya paling luas.

b.    Partisi merupakan prosessorpsi yang analog dengan ekstraksi pelarut. Fase diam cair diikatkan pada paadatan lapisan tipis yang lemban (inert). Karena fase diam diikatkan pada padatan pendukung maka masih diperdebatkan apakah proses sorpsinya merupakan partisi murni atau partisi yang dimodifikasi karena adsorpsi juga mungkin terjadi.

c.    Pertukaran ion merupakan proses yang mana solut-solut ion dalam fasa gerak dapat bertukar dengan ion-ion yang bermuatan sama yang terikat secara kimiawi pada fase diam. Fase diam dapat berupa padatan polimer yang permeabel seperti resin organik yang tidak larut atau silika yang dimodifikasi secara kimiawi. Proses pertukaran ion dapat direpresentasikan sebagai berikut:

Pertukaran anion : X^- + R⁺Y^-             Y^- + R⁺X^-

Pertukaran kation: X⁺ + R⁺Y^-            R⁺ +Y⁺X^-

d.   Eksklusi berbeda dengan mekanisme sorpsi yang lain, yakni dalam eksklusi tidak ada interaksi spesifik antara solut dengan fasa diam. Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat pengepak fasa diam. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous yang inert) sebagai fase gerak digunakan cairan. Kromatografi jenis ini dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur dan ukuran molekul.

Penjerap atau fase diam yang digunakan pada KCKT hampir serupa dengan yang digunakan pada KLT, penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adlah partisi dan adsorpsi. Lapisan tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang digunakan untuk pemisahan kiral. Kebanyakan penjerap dikontrol dengan keajekan ukuran partikel dan luas permukaanya.

2.    Elektroforesis

Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika,Taksonomi dan Bio-sistematik).

Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan.

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.

Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:

1.    Ukuran molekul protein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.

2.    Konsentrasi gel

Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

3.    Bufer (penyangga)

Bufer dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

4.    Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relative stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid.

Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid. Kekuatan voltase Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein. Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negative menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah.

Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan.

Berbeda dengan logam biasa, logam berat biasanya menimbulkan efek-efek khusus pada makhluk hidup. Dapat dikatakan bahwa semua logam berat dapat menjadi bahan racun yang akan meracuni tubuh makhluk hidup. Namun demikian, meski semua logam berat dapat mengakibatkan keracunan atas makhluk hidup, sebagian dari logam-logam berat tersebut tetap dibutuhkan oleh makhluk hidup. Kebutuhan tersebut berada dalam jumlah yang sangat sedikit. Tetapi bila kebutuhan dalam jumlah yang sangat kecil itu tidak terpenuhi, maka dapat berakibat fatal terhadap kelangsungan hidup dari setiap makhluk hidup. Karena tingkat kebutuhan logam oleh tubuh sangat penting maka logam-logam tersebut juga dinamakan sebagai logam-logam esensial tubuh. Istilah logam secara khas mencirikan suatau unsur yang merupakan konduktor listrik yang baik dan mempunyai konduksitas panas, rapatan, mudah tempa kekerasan dan keelektropositifan tinggi. Logam memperlihatkan rentang toksisitas yang lebar. Beberapa logam, misalnya timbal dan merkuri bersifat sangat toksik, logam lainnya misalnya titanium, hampir tidak beracun. Logam juga memiliki berbagai jenis sifat tosik.

3.    Spektroskopi Serapan Atom (SSA)

Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) adalah suatu metoda analisis untuk penentuan konsentrasi suatu unsur dalam suatu cuplikan yang didasarkan pada proses penyerapan energi radiasi oleh atom-atom yang berada pada tingkat dasar (ground state), untuk mengeksitasi elektron terluar. Teknik ini merupakan spektroskopi atom yang pertama kali dapat diandalkan untuk menganalisa adanya logam dalam sampel yang berasal dari lingkungan.

Dalam AAS dilakukan pengukuran serapan (absorbsi) yang dialami oleh seberkas sinar yang melalui kumpulan atom-atom. Serapan akan bertambah dengan bertambahnya jumlah atom yang menyerap sinar tersebut. Prinsip utama dari metode AAS adalah bila larutan suatu senyawa tertentu diaspirasikan ke dalam nyala maka senyawa ini akan menguap lalu akan terurai menjadi uap-uap atom bebas (proses atomisasi). Uap-uap atom bebas tersebut akan menyerap energi radiasi yang berasal dari lampu katoda cekung (Hollow Cathode Lamp) pada panjang gelombang yang khas dan karakteristik untuk setiap unsur.

Proses penyerapan energi terjadi pada panjang gelombang yang spesifik dan karakteristik untuk tiap unsur. Intensitas radiasi yang diserap sebanding dengan jumlah atom dalam sampel sehingga dengan mengukur intensitas radiasi yang diserap (absorbansi) atau mengukur intensitas radiasi yang diteruskan (transmitansi), maka konsentrasi unsur di dalam cuplikan dapat ditentukan. Akibat dari proses penyerapan radiasi tersebut elektron dari atom-atom bebas tereksitasi ketingkat energi yang lebih tinggi. Elektron pada tingkat tereksitasi ini tidak stabil dan akan kembali ke keadaan semula sambil memancarkan energi radiasi dengan panjang gelombang yang khas dan tertentu untuk setiap unsur.

Pada Spektrofotometri Serapan Atom yang diukur adalah banyaknya intensitas sinar yang diserap oleh atom-atom netral yang berada pada tingkat tenaga dasar atau atom-atom yang tidak tereksitasi oleh nyala atom dari unsur yang dianalisis.

Hubungan antara serapan yang dialami oleh sinar dengan konsentrasi analit dalam larutan standar bisa dipergunakan untuk menganalisa larutan sampel yang tidak diketahui, yaitu dengan mengukur serapan yang diakibatkan oleh larutan sampel tersebut terhadap sinar yang sama. Biasanya terdapat hubungan yang linier antara serapan (A) dengan konsentrasi (c) dalam larutan yang diukur dan koefisien absorbansi (a) yaitu dinyatakan dengan hukum Lambert-Beer sebagai berikut:

                                            A = a . b . c

Cara sederhana untuk menemukan konsentrasi unsur logam dalam cuplikan adalah dengan dengan membandingkan nilai absorbans (Ax) dari cuplikan dengan absorbansi zat standar yang dikerahui konsentrasinya.

                    Cx = Ax . Cx

                                As

Ax = Cx

As = Cs

Dimana:        Ax  =  absorban sampel

       As   =  absorban standar

       Cx   =  konsentrasi sampel

       Cs   =  konsentrasi standar

Ada beberapa metode dari teknik spektroskopi serapan atom ini, yaitu:

1.    Metode Nyala (Flame)

Sampel diaspirasikan ke spray chamber lewat kapiler dari nebulizer. Penyedotan ini akibat efek tekanan gas oksidan yang masuk ke nebulizer. Aliran larutan  ini keluar kapiler dengan kecepatan tinggi dan segera menumbuk silica glass bead di depannya sehingga terpecahlah larutan membentuk butir-butir kabut. Kabut ini  bercampur dengan gas membentuk aerosol. Setelah proses pengkabutan, campuran gas naik menuju burner maka terjadi  proses pemanasan dan pengatoman. Setelah itu terjadi penyerapan sinar oleh atom, banyaknya sinar yang diserap berbanding lurus dengan kadar zat. Teknik ini digunakan untuk analisis logam volatile seperti As, Sb, Se, Sn dan hampir semua logam (dalam ppm).

2.    Metode Tanpa Nyala (Flameless)

Atomisasi tanpa nyala dilakukan dengan energi listrik pada batang karbon yang biasanya berbentuk tabung grafit. Contoh diletakkan dalam tabung grafit dan listrik dialirkan melalui tabung  tersebut sehingga tabung dipanaskan dan contoh akan teratomisasikan. Temperatur tabung grafit dapat diatur dengan merubah arus listrik yang dialirkan, sehingga kondisi temperatur optimum untuk setiap macam contoh/unsur yang dianalisa dapat dicapai dengan mudah. Teknik ini juga dpat digunakan untuk hampir semua logam (dalam ppb).

3.    Metode Cold Vapor

Pada metode ini senyawa raksa ( Hg ) dalam contoh uji dioksidasikan dengan penambahan KmnO₄ menjadi Hg²⁺ pada proses destruksi ( dengan waterbath ) pada suhu 95⁰ C, proses destruksi dilakukan dalam suasana asam Hg²⁺ yang terbentuk direduksi oleh SnCl₂ menjadi Hg⁰ ( uap Hg ). Kemudian atom netral tersebut akan menguap sebagai atom-atom bebas dan didorong oleh udara ke sel. Jika cahaya dengan panjang gelombang lampu katoda Hg melalui sel, maka sinar yang diabsorbsi oleh Hg berbanding lurus dengan kadar Hg.

AAS Flame dapat digabung dengan HPLC secara langsung. Teknik ini cocok  dengan laju aliran dan komposisi fase gerak (termasuk pelarut organik) yang umum digunakan dalam HPLC. Dengan mempertimbangkan luas ketersediaan teknik ini, maka HPLC-AAS ini adalah teknik perunut pertama yang digunakan untuk penentuan kompleks logam-protein. Bidang utama pengaplikasiannya adalah deteksi kompleks dengan logam yang memberikan respon paling intens dalam AAS (Cd, Zn, Cu) atau dari spesies yang dapat dikonversi ke hidrida volatil (As, Se, Cd).  

B.       APLIKASI TEKNIK ANALISIS SENYAWA BIOANORGANIK

Penyakit umumnya disebabkan karena adanya perubahan secara tidak normal dalam tubuh manusia, seperti perubahan dalam sintesis atau defisiensi eksresi. Hal ini terjadi karena berlebih atau berkurangnya berbagai unsur kimia dari jumlah yang normal. Oleh karena itu, penentuan mineral menjadi penting untuk diketahui karena berkaitan langsung dengan penyebab penyakit yang merugikan tubuh manusia. Dasar dari penentuan penyakit tersebut adalah dengan mengetahui kuantitas dari berbagai unsur mineral normal dan unsur toksiknya.

Unsur unsur mineral berada dalam nukleoprotein, metalloprotein, kromoprotein, asam nukleat, nukleotida (ATP), enzim (co-enzim A), lipoprotein, dan metabolit lainnya. Unsur mineral dapat dianalisis dari beberapa cuplikan dalam tubuh, seperti darah (Ca, Cl, Mg, P, Fe, Cu, Na, K); urin (Ca, P, Pb, Hg); cairan cerebrospinal (Na, K, Hg); dan feses (Ca). Namun, secara umum dapat diketahui bahwa mineral cenderung lebih banyak ditemukan dalam darah karena berperan utama dalam sistem transport tubuh. Penentuan unsur mineral dapat dilakukan dengan berbagai macam metode yang disesuaikan dengan matriks cuplikan yang akan digunakan.

Unsur mineral kelumit dapat diidentifikasi dengan menggunakan metode dan alat yang memiliki limit deteksi yang rendah, simultan, dan nilai keakuratan yang tinggi. Metode analisis yang dapat digunakan dalam penentuan unsur mineral dalam darah antara lain spektrografi, kolorimetri, reaksi katalistik, fluoresensi sinar X, PIXE (particle induced X-ray emission), ICP-MS (induced coupled plasma mass spectrometry), ICP-AES (induced coupled plasma atomic emission spectrometry), IDMS (isotope dilution mass spectrometry), GF-AAS (graphite furnace atomic absorption spectrometry), ETAAS (electro thermal atomic absorption spectrometry), NAA (neutron activation analysis atau analisis aktivasi neutron, AAN).

Setiap metode memiliki karakteristik dan sensitivitas yang berbeda-beda pada setiap unsur yang dianalisis. Oleh karena itu, hingga saat ini belum ditemukan metode standar dalam penentuan unsur-unsur kelumit dalam suatu organisme.

Analisis logam dalam darah bisa dilakukan dengan metode atau teknik KCKT. Langkah pertama dilakukan pengambilan sampel, kemudian dilakukan destruksi, mereaksikan darah yang telah diambil dengan menggunakan reagen-reagen tertentu dan selanjutnya dilakukan running dalam KCKT sehingga terbaca oleh detektor menjadi kromatogram yang dapat ditentukan kadarnya.

Analisis logam dalam darah juga dapat dilakukan dengan teknik AAS. Sampel yang digunakan dalam analisis ini adalah sampel yang berupa darah keseluruhan (whole blood), sehingga diperlukan digesti terlebih dahulu. Ada dua cara untuk digesti suatu sampel yaitu digesti basah dan digesti kering.

Digesti basah dilakukan dengan prosedur sebagai berikut: Sampel darah dengan berat 1-2 gram dimasukkan dalam gelas Erlenmeyer, kemudian ditambah dengan asam nitrat (HNO3) pekat sebanyak 10 ml dan ditutup dengan gelas arloji. Kemudian dipanaskan di atas hotplate pada suhu 115oC selama sekitar 8-10 jam sampai warnanya menjadi putih, lalu tutup dibuka supaya menguap dan kering. Sampel kering tersebut dilarutkan dalam HNO3 10% sebanyak 5-10 ml tergantung dari berat sampel yang diperoleh, dan dibaca melalui mesin AAS.

Sedangkan prosedur utnuk melakukan digesti kering adalah sebagai berikut: Sampel darah dimasukkan ke dalam cangkir porselen bersih kemudian dikeringkan. Tambahkan 8 ml 65% supra pure asam nitrat (HNO3), kemudian dipanaskan di atas hotplate pada temperature sekitar 75oC selama 3 jam atau lebih dan dibiarkan mongering. Larutkan dalam 10% asam nitrat, disaring melalui kertas saring Whatman 42 dan dimasukkan ke dalam gelas ukur 50 ml dengan menggunakan corong plastic polietilen. Bilas dengan aquabides dan buat larutan menjadi 50 ml, kemudian dianalisis dengan AAS.

Langkah selanjutnya dalam analisis ini yaitu penyiapan larutan standar. Larutan standar dibuat dengan onsentrasi 1000 ppm dari masing-masing logam yang akkan dianalisis. Kemudian larutan standar diencerkan menjadi berbagai konsentrasi yaitu 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, 10 ppm untuk membuat kurva kalibrasi. Setelah itu larutan standar diukur dengan AAS pada panjang gelombang standar untuk masing-masing logam. Langkah terakhir dari prosedur ini adalah pengukuran sampel. Pengukuran sampel dilakukan dengan menganalisa sampel tersebut dengan AAS pada panjang gelombang yang disesuaikan.

BAB III

PENUTUP

Analisis senyawa bioanorganik dapat dilakukan dengan berbagai teknik, diantaranya:

a.         Kromatografi Caira Kinerja Tingkat Tinggi

Detektor yang digunakan dalam KCKT untuk analisis senyawa bionaorganik  adalah detektor UV dan detektor fluoresensi. Sedangkan jenis KCKT yang digunakan dalam analisis senyawa bioanorgani yaitu Kromatografi penuar ion dan kromatografi eksklusi ukuran.

b.        Elektroforesis

Analisis yang didasarkan pada proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Metode ini dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).

c.         Spektroskopi Serapan Atom

Analisis yang didasarkan pada proses penyerapan energi radiasi oleh atom-atom yang berada pada tingkat dasar (ground state), untuk mengeksitasi elektron terluar. Metode ini digunakan untuk menganalisa adanya logam dalam sampel yang berasal dari lingkungannya.